SEQUENCING. . .: metode untuk memahami kehidupan

Sekuencing adalah metode yang digunakan untuk  menentukan urutan nukleotida pada sekuen atau untaian DNA. Meskipun penemuan struktur DNA  dobel helix telah diketahui sejak tahun 1953, akan tetapi struktur gen dan genome baru dapat diperjelas pada tahun 1970-an dengan metode sekuencing. Basa nukleotida yang pertama kali di sekuencing sepanjang 24 bp pada E. coli yang berpedan sebagai pengikat repressor lac oleh Maxam-Gilbert :

   TGGAATTGTGAGCGGATAACAATT

              ACCT T AACACTCGCCTAT TGTTAA

Ini merupakan suatu karya yang di dapatkan dengan bersusah payah selama beberapa tahun. Galvanis Gilbert dan rekannya Alan Maxam untuk menciptakan  metode sekuensing berdasarkan sifat kimia pembelahan molekul DNA pada spesifik c jenis nukleotida. Teknologi kedua, dikembangkan oleh Fred Sanger, sdan di publikasikan pada tahun 1977, didasarkan pada enzimatik  perpanjangan untai DNA ke basis mengakhiri defined. Gilbert dan Sanger keduanya memenangkan Hadiah Nobel untuk kontribusi mereka  untuk sekuensing DNA teknologi. Teknik mereka  memiliki throughput yang sama 500-700 basis diperoleh dalam  setiap percobaan beberapa hari-panjang, dan akurasi yang sama,  yang mendekati 99,9%. Tapi hanya teknik Sanger  adalah mudah setuju untuk otomatisasi, dan sekuensing DNA  mencapai potensi penuh hanya dengan otomatisasi.  

Pada hakekatnya, semua data yang ada sekarang merupakan sebuah perjalanan panjang sehingga terkumpul menjadi bank data, di mulai dari bagaimana cara sekuencing yang ters berubah-ubah dan mengalami pembaharuan dan modifikasi. Perkembangan ini tidak lepas dari kinerja multidiscipline ilmu yang harus saling berkolaborasi. Misalnya Microbiologi, biokimia, molecular biologi, microbiologi, perangkat peralatan keras dan computer.

Proyek besar seperti Human Genome Project (HGP), membutuhkan spesialisasi keahlian, terlebih lagi inovasi dari beberapa sector ilmuan, di butuhkan ilmuan dari beberapa multidisiplin yang saling berkolaborasi secara efektif. Semua data di kolaborasikan bersama dalam data base besar yang disebut dengan bank genes yang sekarang salah satunya terpusat pada www.ncbi.nlm.nih.gov , web ini juga merupakan arena komunikasi data bagi seluruh ilmuan yang penelitiannya berkaitan dengan sekuent nukleotida, sehingga penelitian di duania ini dapat berjalan dengan harmonis.

Metode Maxam-Gilbert 

Metode maxam gilbert untuk DNA sekuencing di kempbangkan pada pertengahan 1970-an, dan menggunakan perbandingan fragmen nested, artinya membandingkan dari banyak sekuen pada taraf PCR dengan dengan cara mengubah conformasi dari struktur basa pada nukleotida. Pengubahan struktur tersebut menggunakan bahan kimia sehingga metode ini sering disebut juga metode sekuncing kimia.

Pada metode ini, untaian tunggal DNA di labeli pada ujung 5’, yang konformasinya dirubah menggunakan reagent yang spesifik. Biasanya menggunakan  Dimetil sulfat dan piperidin untuk basa guanin. Perlakuan Adenin dengan pembeian Dimetil sulfat, piperidin dan asam.  Perlakuan Timin dengan pemberian Hydrazine dan piperidin. Perlakuan Cytosin, dengan pemberian Hydrazine, piperidin dan garam (Gambar 1). Cara kerja selanjutnya yaitu di lihat menggunakan gel poliakrilamit, yang akan menghasilkan penampakkan dari pelabelan tadi, tetapi akan mendapatkan ujung yang berbeda-beda karena adanya perubahan konformasi. Sekuent dapat di baca menggunakan autoradiograph.

Melalui penemuan ini maxam dan gilbert mendapat anugrah Bobel prize. Metode ini di anggap lebih maju dari pada metode sanger (diuraikan kemudian), karena tidak menggunakan primer. penerapannya secara inheren terbatas pada urutan yang berdekatan dengan situs pembatasan atau termini tetap lainnya. kelemahan lainnya yaitu menggunakan reagen yang beracun yaitu hydrazine yang merupakan neurotoxin.

            Metode ini mulanya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian, sedangkan metode Sanger pada waktu itu memerlukan kloning untuk membentuk DNA untai tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi rantai, metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam scale-up.

Gambar  1 : metode Maxam-Gilbert (metode kimiawi), Perlakuan basa G dengan menggunakan Dimetil sulfat dan piperidin. Perlakuan A dengan pembeian Dimetil sulfat, piperidin dan asam.  Perlakuan T dengan pemberian Hydrazine dan piperidin. Perlakuan C, dengan pemberian Hydrazine, piperidin dan garam.

Gambar 2 : Gambaran/alur sekuensing metode Maxam-Gilbert  

Metode Sanger

Gambar 3 : Frederick Sanger

Frederick sanger, mendidakasikan dirinya di dalam bidang untuk mengetahui urutan molekul biologi. Karya pertamanya adalah dapat menguraikan komponen asam amino pada insulin, hingga dia mendapat anugrah nobel di bidang kimia pada tahun 1958 (Sanger, 1958). Karya selanjutnya ialah ia mampu menguraikan urutan nukelotida pada untaian DNA sehingga ia mendapatkan Nobel untuk yang kedua kalinya pada tahun 1980 bersama rekan-rekannya Paul Berg, dan Walter Gilbert.  Sebagai gambaran, pada masa itu sangat sulit untuk memurnikan DNA, pada masa tersebut enzim restriksi juga masih merupakan barang baru. Sehingga semua di lakukan secara konvensional, berbeda dengan sekarang yang segala sesuatunya sudah ada. Sanger meggunakan ØX- 174 sebagai objek penelitiannya. Memiliki panjang genom 5386 bp. Meskipun memiliki ukuran yang cukup panjang pada satu running. Namun Sangee percaya bahwa metode ini dapat mengungkap secara mendetail urutan basa nukleotida pada untaian DNA. Metode sanger meniru metode yang berada pada Transkripsi sehingga mirip dengan Polimarase chain rection (PCR), yang menggunakan DNA polymerase  untuk mensintesis strand complement baru, , sehingga dalam metode ini juga membutuhkan primer (sekuan pendek yang complement dengan DNA target)  sebagai penyedia gugus fosfat.

Point utama dalam metode ini adaah digunakannya ddNTP (gambar 4), yang   merupakan gula ribose yang kehilangan dua gugus O, sehingga reaksi tidak dapat berlanjut. ddNTP juga sudah mendapat perlakuan pelabelan sehingga dapat diamati secara baik. ddNTP akan menempel secara random  sehingga akan mengisi sela-sela dNTP (gula ribose yang dibutuhkan secara normal pada reaksi PCR). Urutan-urutan random yang dihasilkan kemudian di gabungkan sehingga mampu menjelaskan urutan nuklotida.

 

Gambar 4: Perbandingan antara struktur dedeoxiNTP (kiri) dengan deoxiNTP (kanan)

Gambar 5: Gambaran sekuencing metode sanger

 

Pada metode yang asli, urutan nukleotida DNA tertentu dapat disimpulkan dengan membuat secara paralel empat reaksi perpanjangan rantai menggunakan salah satu dari empat jenis basa pemutus rantai pada masing-masing reaksi. Fragmen-fragmen DNA yang kemudian terbentuk dideteksi dengan menandai (labelling) primer yang digunakan dengan fosfor radioaktif sebelum reaksi sekuensing dilangsungkan. Keempat hasil reaksi tersebut kemudian dielektroforesis pada empat lajur yang saling bersebelahan pada gel poliakrilamida.

Hasil pengembangan metode ini menggunakan empat macam primer yang ditandai dengan pewarna berpendar (fluorescent dye). Hal ini memiliki kelebihan karena tidak menggunakan bahan radioaktif; selain menambah keamanan dan kecepatan, keempat hasil reaksi dapat dicampur dan dielektroforesis pada satu lajur pada gel. Metode ini dikenal sebagai metode dye primer sequencing.

Gambar 6: Poliacrilamit gel yang digunakan untuk sekuencing