Sequensing DNA secara otomatis

Sequencing DNA secara otomatis menggunakan flurosense sebagai reporter. Metode ini pertama kali diperkenalkan oleh Leroy Hood pada tahun 1986, yang menggunakan radioaktif, autoradiografi dialih fungsikan dengan menggunakan detector yang diintegrasikan dengan computer (Anonym, 2005).

 Penggunaan radioisotope memiliki bahaya dalam menggunakan dan limbah, selain itu harganya yang juga mahal. Degnan cara menempelkan flouresense dye,  pada tiap basa nukleotida (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) membuat setiap basa tersebut mampu memberikan signal yang berbeda-beda, tergantung pada posisi mana proses elongasi itu berakhir. Metode elektroforesis membedakan pada satu jalur. Kemudian di deteksi oleh sinar laser sehingga mampu menghasilkan cromatografi seperti pada Gambar 1.

Gambar 1. Prinsip kerja mesin sekuencing otomatis

Pada tahun 1986, L. Hood, L. Smith dan teman-teman kerjanya mendeskripsikan sekuencing berdasarkan penempelan flouresense yang menggambarkan cara kerja mesin DNA sequencing otomatis.  Instrument tersebut kemudian di produksi oleh Applied Biosystems. Pengembangan selanjutnya yaitu metode kapilar, yang memungkinkan analisa yang lebih akurat, tujuan utama modifikasi-modifikasi yang di lakukan adalah untuk mempercepat waktu dalam pelaksanaan. Pada tahun 1998 metode kapiler sudah dapat di lakukan dan di manfaatkan pada project Human Genome Project (HGP) dan mampu mensekuen 1 Mb per hari. 

Gambar 2: metode sekuencing kapiler.

Pemisahan produk dari reaksi sekuensing dideoksi berlabel radioaktif atau neon secara historis dilakukan dalam gel poli-akrilamida slab, misalnya jenis yang digunakan dalam 96-lane ABI 377 (Gambar 2). Kelemahan dari metode ini diantaranya  perlunya mempersiapkan gel baru untuk setiap sekuensing, pengisian sampel secara manual ke gel, membutuhkan waktu running  yang  relatif lama (8 ~ 10 jam untuk resolusi fragmen DNA 1KB).

Sekuensing elektroforesis kapiler merupakan serangkaian reaksi standar yang disusun sekuensing DNA dideoksi (metode sanger), masing-masing satu sumur  terdiri dari 8 baris x 12 kolom  dan 96 plat . Serangkaian ultra-tipis tabung kapiler (0,1 mm di dalam lubang, 50 ~ 80 cm panjang) yang diisi dengan resin campuran manik dan ditempatkan dalam array multi-kapiler. Salah satu ujung array dipasang di plate Katoda bermuatan negatif [kanan] sehingga ujungnya sejajar dengan setiap sumur pelat sampel. Penerapan tegangan tinggi menyebabkan DNA berlabel dalam setiap sampel dapat memasuki kapiler yang sesuai, dan bermigrasi meskipun menuju reservoir Anoda bermuatan positif. Karena tegangan tinggi yang digunakan, pemisahan elektroforesis hanya membutuhkan 1 ~ 3 jam. Seperti dalam elektroforesis gel biasa. fragmen yang lebih kecil bergerak lebih cepat daripada yang lebih besar. Sebuah laser di ujung mendeteksi pewarna yang berflourosense, dan panjang gelombang fluoresensi setiap fragmen dibaca oleh fotometer saat melewati titik tetap.

Laser dan fotometer bersifat stasioner, dan dapat mengaktifkan dan membaca beberapa kapiler secara bersamaan sebagai aliran data terpisah: ini meminimalisir masalah pelacakan jalur terpisah dalam gel acrilamite. Data mobilitas dikirim ke komputer, dan kromatogram yang dihasilkan untuk setiap sampel yang pada dasarnya identik dengan sistem papan gel.  Konfigurasi alternatif dari array kapiler dapat membaca 1, 4, 16, atau 48 sumur secara bersamaan, bergerak antara sumur dari pelat sampel secara otomatis secara teratur.